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真的假的?COVID-19陽性與否,PCR的篩檢其實存在「灰色地帶」?

真的假的?COVID-19陽性與否,PCR的篩檢其實存在「灰色地帶」?-COVID-19

文字/柯皓翔、插畫/藍酪

6月24日,一名從台灣返回日本的女留學生,在日本檢出 COVID-19(又稱武漢肺炎、新冠肺炎)陽性,引起台灣是否潛藏社區感染的討論。中央流行疫情指揮中心後來聲明,女學生的檢測數據,應是落在「灰色地帶」,其中關鍵,就是台、日對PCR檢測數據的判讀。

目前,國際標準確診檢測工具都是針對病毒核酸進行PCR(polymerase chain reaction,聚合酶連鎖反應)。PCR檢測到底是什麼?有什麼不同種類?它的原理為何、又為何會出現指揮中心所說的「灰色地帶」 呢? 

PCR為何是診斷工具的跨時代革命?

PCR中文為「聚合酶連鎖反應」,是實驗室診斷工具重大的革命,但其實,PCR很晚才被發明出來。

過去病毒、細菌檢測診斷或實驗最大的限制,是研究或檢測到一半,檢體和樣本就不夠用,必須透過「細胞培養」等方式,觀察細胞在感染病毒後是否產生病變(cytopathic effect, CPE),過程相對耗時費力。

1983年,美國化學家凱利.穆利斯(Kary B. Mullis)想到以參與DNA複製的「聚合酶」來複製實驗樣本的DNA,這個方法只要少量的DNA,就可以無限量複製,讓PCR的反應能在試管中又快又容易地進行,不只大大提升病菌檢測的時效,也帶動新藥的研發。1993年,穆利斯因而獲得諾貝爾化學獎。

PCR百百種,COVID-19用的是哪一種?

之後,PCR成為分子生物主要技術,並在此基礎上不斷推陳出新,常見的有「即時聚合酶連鎖反應(Real-Time PCR)」、「聚合酶連鎖反應─限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)」、「巢式聚合酶連鎖反應(Nested PCR)」及「多重聚合酶連鎖反應(Multiplex PCR)」等等。

這次用在COVID-19確診病例診斷上,包括台灣在內,多使用「即時反轉錄聚合酶連鎖反應(Real-Time RT-PCR)」,即將新型冠狀病毒的RNA「反轉錄」(「轉錄」是指將DNA上的遺傳訊息,抄錄到RNA的過程;「反轉錄」則是反向,透過「反轉錄酶」作用,以RNA為模板,合成出互補DNA(cDNA))成互補DNA後,再進行DNA擴增反應(互補DNA可以當作模板,在一輪輪的升降溫循環中,不斷重複「DNA變性」、「引子黏合」、「引子延長」的步驟,使雙股DNA從1條變2條,2條變4條,不斷乘以2,產生指數級放大),並以螢光染劑偵測每次PCR循環後產物總量,藉以判斷疑似病例檢體中是否含有病毒基因,是一種即時、定量的檢測技術。

這個檢測有兩大關鍵:第一,必須找到專一性高的「引子」(primer)(人工合成的短DNA片段,可以黏合在單股DNA上,界定複製的目標起始點和終點,一旦和DNA聚合酶結合,就會進一步延長,合成出DNA新的一股)釣出病毒特定片段,由於引子設計有螢光標記,會隨反應過程增加亮度、被儀器記錄下來,因此能換算出病毒數量。此次世界衛生組織(WHO)在1月,即對各國公布COVID-19的病毒引子;第二,則是要算出病毒「陽性」定量的Ct值(cycle threshold)──即螢光亮度到達設定的閾值所歷經的循環數。如Ct值是38、代表檢體在歷經38輪放大後,觀測到螢光達到閾值,Ct值愈高,代表病毒RNA濃度愈低、患者體內病毒愈少
 

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